MULTIPLEX LÀ GÌ

  -  
Xét nghiệm sinh hóaXét nghiệm ngày tiết họcXét nghiệm tụ máu - miễn dịchXét nghiệm nước tiểu - vi sinhXét nghiệm di truyền và SHPT
*

*

*

*

*

Nhóm thiết bị có tác dụng lạnhNhóm thiết bị có tác dụng nóngNhóm đồ vật cơ họcNội thất phòng thí nghiệmCân/pH/Lọc/Pipet/Bơm...

Bạn đang xem: Multiplex là gì


Hóa hóa học cơ bản/phân tíchHóa hóa học sinh họcSinh phẩm xét nghiệmPipet/Vật tứ tiêu haoHóa chất sinh học tập phân tử
Các chuyên môn phân tíchCác kỹ thuật rước mẫuPhân các loại môi trườngCác dự án môi trường - chuyển giao công nghệMôi trường và cuộc sống
isys.com.vn

1. Ra mắt chung về multiplex PCR

Multiplex PCR là một phương pháp sinh học tập phân tử phổ biến nhằm mục đích khuếch đại nhiều trình từ bỏ ADN chỉ trong một bội nghịch ứng PCR. Trong quá trình phân tích PCR nhiều mồi, các trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc áp dụng nhiều cặp mồi, tất cả các nguyên tố được bổ sung vào và một ống phản ứng. Như 1 phương pháp cải tiến của bội nghịch ứng PCR thông thường, phương thức này góp rút ngắn thời hạn thực hiện mà lại không tác động tới hiệu quả thí nghiệm.

Các một số loại phản ứng multiplex PCR

Phản ứng multiplex PCR tất cả thể phân thành 2 loại:

a) phản nghịch ứng multiplex PCR cần sử dụng một khuôn

Phương pháp này sử dụng một một số loại khuôn, hay là ADN hệ gen, thuộc với các cặp mồi (các mồi xuôi với mồi ngược) để khuếch đại một vùng gen cụ thể có đựng trong sợi khuôn.

b)Phản ứng multiplex PCR dùng các khuôn

Có thể tiến hành duy tuyệt nhất một phản ứng với tương đối nhiều loại khuôn và những cặp mồi. Tuy vậy sự xuất hiện của những cặp mồi có thể dẫn tới việc liên kết chéo giữa các mồi với nhau và rất có thể có sự bắt cặp nhầm giữa mồi này cùng khuôn kia. Vì vậy việc kiến thiết mồi là khôn xiết quan trọng.

*

2. Xây dựng mồi mang đến phản ứng multiplex PCR

Thiết kế mồi đặc hiệu là trong những yếu tố đưa ra quyết định đến sự thành công xuất sắc của phản bội ứng multiplex PCR. Các để ý quan trọng khi xây cất mồi đến phản ứng này được liệt kê bên dưới. Đây có thể coi là chìa khóa quyết định sự chính xác của quy trình khuếch đại các trình từ bỏ ADN với hàm lượng sản phẩm cao nhất.

a) Chiều lâu năm mồi

Phản ứng multiplex PCR chứa được nhiều cặp mồi không giống nhau, vị vậy nó yên cầu các mồi có phong cách thiết kế phải bao gồm chiều lâu năm thích hợp. Thường thì các mồi gồm chiều dài khoảng chừng từ 18 cho 22 nucleotide.

b) ánh sáng nóng tung của mồi (Tm)

Các mồi đề nghị có nhiệt độ nóng chảy tương tự nhau, rất tốt là nằm trong vòng từ 55°C - 60°C. Với hầu như trình từ bỏ có phần trăm GC cao, Tm của mồi có thể cao rộng (khoảng 75°C - 80°C). Độ xấp xỉ về Tm giữa các mồi cần nằm trong vòng 3°- 5°C.

c) Độ sệt hiệu

Độ quánh hiệu là vấn đề cần được quan tâm hàng đầu trong vượt trình xây đắp mồi. Với bội nghịch ứng multiplex PCR nó càng trở đề nghị quan trọng, đặc biệt là trong những phản ứng có xảy ra cạnh tranh về mồi với khuôn.

d)Tránh có mặt dimer primer

Các mồi được thiết kế với nên được bình chọn xem chúng có hình thành dimer không. Dimer primer (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau) hoàn toàn có thể dẫn đến việc khuếch đại không quánh hiệu.

Tất cả những chỉ số cần để ý khi xây đắp mồi gần giống với kiến tạo mồi cho 1 phản ứng PCR thông thường. Thông thường, khi phần trăm Mồi/Khuôn tương đối cao cũng hoàn toàn có thể dẫn đến sự việc hình thành primer dimer, vì vậy phải chú ý chỉ số của những thành phần trong phản ứng.

e) xây đắp mồi mang lại phản ứng multiplex PCR bởi phần mền PrimerPlex

PrimerPlex là một trong những công cụ có lợi cho vượt trình thi công mồi so với phản ứng multiplex PCR. Công tác này giúp kiểm tra các oligo xem chúng gồm phản ứng chéo cánh với nhau giỏi không, bên cạnh đó tăng sự phù hợp ứng giữa các mồi. Quy trình này so với hàng triệu cặp mồi khả dĩ chỉ trong vài giây, kế tiếp chương trình đưa ra danh sách các mồi nhằm người kiến tạo lựa chọn.

3. Ưu điểm của phương thức multiplex PCR

a) Đối hội chứng nội kiểm (Internal control)

Vấn đề thường gặp gỡ trong phản bội ứng PCR hiếm hoi (Single PCR) là hiện tượng âm thế giả vì chưng sai về những thành phần hay chu trình nhiệt, cũng đều có khi lại là hiện tượng lạ dương tính giả bởi bị nhiễm. Phương thức multiplex PCR đang khắc phục được hiện nay tượng cõi âm giả bởi mỗi sản phẩm khuếch đại sẽ hỗ trợ một giá trị giúp kiểm tra các phân đoạn được khuếch đại khác.

b) tác dụng cao

Chi chi phí về chất hóa học và thời hạn tiến hành multiplex PCR giảm đáng nói so cùng với một phản bội ứng PCR solo lẻ. Những phản ứng multiplex PCR cũng đảm bảo được thời gian chịu đựng của enzyme polymerase cùng khuôn.

Xem thêm: Cách Tải Minecraft Pc Miễn Phí Cho Máy Tính Windows, Mac, Linux

c) xác minh được chất lượng khuôn

Phản ứng multiplex PCR hoàn toàn có thể xác định được unique mẫu (khuôn) tác dụng hơn bội nghịch ứng PCR thông thường.

d) khẳng định được các chất khuôn

Lũy thừa những số lượng phiên bản sao và những tiêu chuẩn chỉnh của phản bội ứng multiplex PCR có thể được áp dụng để mong lượng các chất khuôn gồm trong mẫu. Để khẳng định được hàm lượng khuôn chính xác bằng phản nghịch ứng multiplex PCR rất cần được có mẫu mã đối chiếu, số chu kỳ phản ứng và lượng tối thiểu hóa học ức chế phải được khẳng định sau từng mỗi chu kỳ luân hồi khuếch đại.

Phản ứng multiplex PCR hoàn toàn có thể ứng dụng trên cả khuôn là ARN sau khoản thời gian chuỗi này được chuyển thành dạng cADN. Sợi cADN sẽ đóng vai trò làm khuôn cho phản ứng.

4.Tối ưu hóa những thành phần cho phản ứng multiplex PCR

a) mật độ mồi

Nồng độ mồi lúc đầu cho bội phản ứng bao gồm nồng độ trường đoản cú 0.1 µM mang lại 0.5 µM. Hoàn toàn có thể điều chỉnh chỉ số này tùy thuộc vào từng điều kiện phản ứng, ví dụ, fan ta có thể tăng lượng chất mồi so với các locus “yếu” và sút nồng độ mồi với các locus “mạnh”. Nồng độ ở đầu cuối của từng mồi trong phản nghịch ứng đề xuất nằm trong tầm từ 0.04 µM mang đến 0.5 µM. Với số lượng bản sao thấp hay ADN phức tạp, độ đậm đặc mồi đề xuất nằm trong khoảng 0.3 µM mang đến 0.5 µM. Ngược lại nếu số lượng phiên bản sao bự hay ADN khuôn ít tinh vi thì mật độ mồi yêu cầu nằm trong vòng 0.04 µM cho 0.4 µM.

b) mật độ dNTP với MgCl­­2

Nồng độ MgCl­­2 cần giữ cố định và thắt chặt ở mức 2 mM. độ đậm đặc dNTP rất có thể dao đụng từ 0.5 mM đến 1.6 mM. Nồng độ thích hợp nhất của từng một số loại dNTP là trường đoản cú 0.2 mM mang đến 0.4 mM. Thừa ngưỡng này sẽ làm cho giảm tốc độ phản ứng. độ đậm đặc mỗi nhiều loại dNTP thấp rộng 0.1 mM sẽ vẫn duy trì được vận tốc phản ứng cơ mà lại làm giảm con số sản phẩm. DNTP cội (stock) nhạy bén với quy trình rã đông, cho nên làm kết quả phản ứng multiplex PCR hoàn toàn có thể giảm. Để tương khắc phục điểm yếu kém này, dNTP bắt buộc được phân thành từng lượng nhỏ trước khi bảo vệ ở -20ºC.

Do MgCl­­2 ảnh hưởng trực sau đó hiệu quả buổi giao lưu của enzyme Taq ADN polymerase phải nồng độ Mg2+ yêu cầu được đánh giá chặt chẽ. Enzyme Taq polymerase, khuôn, dNTP và những mồi đều liên kết với MgCl­­2 cần nồng độ MgCl­­2 phụ thuộc vào nồng độ những thành phần này. Rộng nữa, nếu khuôn hoặc mồi gồm chứa EDTA hay EGTA thì nồng độ MgCl­­2­ cũng trở thành được điều chỉnh. Mg2+ giúp ổn định cấu tạo sợi đôi, bảo đảm an toàn ADN khỏi bị trở thành tính. Nồng độ Mg2+ cao rất có thể dẫn tới sự việc làm tăng lượng hàng hóa không quánh hiệu vì nó tác động đến quy trình gắn mồi lên sợi khuôn. Tuy nhiên nếu các chất Mg2+ ko đủ cũng biến thành làm giảm lượng sản phẩm cần thiết.

c) Sự cân bằng dNTP/ MgCl­­2­

Để thao tác hiệu quả, Taq ADN polymerase yêu cầu Mg thoải mái (bên cạnh Mg link với dNTP và ADN). Đây là lí do nguyên nhân khi tăng mật độ dNTP thì tốc độ phản ứng PCR lại giảm trong những khi đó tăng mật độ Mg lại cho hiệu quả ngược lại. 0.2 milimet dNTP kết phù hợp với 1.5 mang đến 2 mm MgCl2 là hòa hợp lí.

d) Nồng độ hỗn hợp đệm (buffer)

Dùng đệm nồng độ 2X sẽ nâng cấp hiệu quả của bội nghịch ứng multiplex PCR. Nó công dụng hơn bất kỳ chất điều chỉnh nào (như DMSO, glycerol, BSA). Những cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN gồm chiều dài mập sẽ chuyển động tốt hơn ở nồng độ muối bột thấp trong khi các cặp mồi dùng làm nhân những đoạn ADN ngắn lại yêu ước nồng độ muối cao hơn.

e) Lượng ADN khuôn cùng Taq ADN polymerase

Khi lượng khuôn ADN thấp, tác dụng khuếch đại và độ quánh hiệu của làm phản ứng có thể tăng lên giả dụ hạ thấp nhiệt độ gắn mồi. Tín đồ ta tiến hành thử nghiệm ở những nồng độ Taq ADN polymerase không giống nhau, tiếp đến đưa ra được nồng độ về tối ưu so với enzyme này 2.5U/ 50µl dịch phản bội ứng. Nếu vô số enzyme, mật độ glycerol cần sử dụng để bảo quản enzyme rất có thể làm mất cân đối quá trính khuếch đại làm tăng sự nhiễu. Tỷ lệ mồi đặc hiệu cùng hỗn hợp phụ thuộc vào hoạt tính của enzyme, những thành phần rất cần thiết trong bội phản ứng như MgCl2, dNTPs và bản chất của ADN đích. Vày vậy, hàng loạt các cải tiến được thực hiện nhằm cải thiện quá trình PCR chủ yếu kim chỉ nan trực tiếp vào những yếu tố ảnh hưởng tác động đến việc gắn mồi và kéo dãn dài chuỗi.

f) Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA

Hầu hết các phản ứng multiplex PCR khó thực hiện đều nên được cung cấp bởi những chất phụ gia như DMSO, glycerol, formamide cùng betaine. Phần lớn phụ gia này giúp có tác dụng lỏng chuỗi ADN, vì vậy ADN thuận lợi bị đổi mới tính bởi nhiệt nhanh hơn. Tuy nhiên, trong số phản ứng multiplex PCR, DMSO với glycerol lại gây ra sự cạnh tranh. Vì vậy, nồng độ của các chất này cũng nên được xem như xét đánh giá chặt chẽ. độ đậm đặc BSA đạt mức 0.8 µg/µl sẽ làm cho tăng hiệu quả phản ứng hơn nhiều so với việc bổ sung cập nhật DMSO và glycerol.

5. Ứng dụng của phản nghịch ứngmultiplex PCR

Multiplex PCR có rất nhiều ứng dụng rộng lớn rãi, tất cả thế khẳng định sự xuất hiện cùng lúc nhiều tác nhân không giống nhau như virus, vi khuẩn và những tác nhân xâm lây nhiễm khác. Đồng thời, bội nghịch ứng multiplex PCR cũng được dùng để xác định các thành phần bao gồm trong mộthỗn hợp chủng loại hoặc cũng hoàn toàn có thể dùng để khẳng định sự có mặt của các gen hiếm hoi trong hệ gen.

Xem thêm: Gặp Hạn Trạch Khốc Là Gì ? Cách Tính & Hóa Giải Hướng Nhà Không Hợp Mệnh 2021

*

Nguồnhttp://www.chimicare.org

Phản ứng multiplex PCR được sử dụng vào các mục đích:

1. Xác minh tác nhân tạo bệnh

2. Năng suất SNP genotyping cao

3. Vạc hiện bỗng dưng biến

4. Phát hiện tại đột biến mất trong gen

5. Định lượng mẫu

6. Phân tích những liên kết

7. Phát hiện nay ARN

8. Nghiên cứu và phân tích pháp y

Tài liệu tham khảo

1. P Markoulatos, N. Siafakas and M. Moncany (2002),"Multiplex Polymerase Chain Reaction: A Practical Approach",Journal of Clinical Laboratory Analysis,(16), pp.47-51.